具體描述
內容提要
本教程的實驗是以pUC118質粒為載體剋隆一卡那
黴素抗性基因，轉化子鑒定用快速抽提酶切法與非放射
性標記探針的菌落原位雜交法。整個實驗過程包括質粒
抽提、電泳、酶切、片段迴收、連接、轉化、快速鑒定、探針
標記、原位吸印、雜交與檢測等基因工程的最基礎的實驗
步驟。除上述係列實驗外還有一獨立的PCR實驗――用
頭發進行人的性彆鑒定。
本書可作為基因工程實驗課程的教材，也可供生物
學科有關各專業教師和科研人員參考。
作者簡介
目錄資訊
緒論
本教程基因工程實驗流程圖
實驗一 堿法抽提質粒DNA
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）剋隆載體pUC118質粒與宿主菌MV1184
1pUC118質粒結構
2MV1184宿主菌F＇因子基因型
3MV1184宿主菌染色體基因型
（二）質粒DNA的抽提
1裂解細胞
2分離
3純化
（三）堿法抽提的主要試劑
（四）抽提産量與試劑用量的估算
1抽提産量估算
2試劑用量估算
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗二 電泳法測定DNA的濃度與純度
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）瓊脂糖凝膠
（二）電泳時DNA遷移的影響因素
1DNA分子質量的影響
2DNA構型的影響
3膠濃度的影響
4電場強度的影響
5溴乙錠的影響
6電泳緩衝液的影響
7堿基組成與電泳溫度的影響
（三）電泳緩衝液
1TAE
2TBE
3TPE
（四）上樣液
（五）上樣量的控製
（六）DNA電泳條帶的檢測
（七）電泳的分子質量梯度標誌
1綫狀分子質量梯度標誌
2超螺鏇分子質量梯度標誌
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗三 載體與供體DNA的酶切
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）限製性內切酶的一般性質
1一般限製酶的識彆位點
2識彆超長堿基序列的酶
3各類粘性末端的特點
4同識彆序列的酶
5酶切反應中的位點優先現象
6DNA構型對酶切的影響
7近末端切割
8酶的星號反應
9大腸杆菌中甲基化現象對酶切的影響
10能切割單鏈的限製酶
（二）限製性內切酶的使用
1製作基因圖譜
2剋隆基因
3製備探針
（三）酶切方式
1部分酶切
2完全酶切
（四）酶的質量鑒定
（五）酶的保存
（六）酶單位的定義
（七）限製酶的作用條件
1作用溫度
2緩衝體係
3反應時間
4DNA的純度與濃度
（八）終止酶反應的方法
（九）酶切失敗的原因及處理的方法
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗四 目的基因片段的迴收
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）各類迴收方法
1電泳迴收法
2收集孔電泳迴收法
3機械破碎凝膠迴收法
4溶（熔）膠迴收法
5瓊脂糖酶降解凝膠迴收法
（二）迴收方法的選擇與操作注意事項
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗五 載體與供體DNA的連接
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）早期的連接理論
（二）近期的計算機模擬反應進程
（三）連接酶
（四）連接反應的影響因素
1連接緩衝液的影響
2pH值的影響
3ATP濃度的影響
4連接溫度與時間的影響
5酶濃度的影響
6DNA濃度的影響
7DNA序列的影響
8其他抑製因素的影響
（五）三種連接酶單位定義
1Weiss單位
2d（A―T）環化單位
3粘性末端單位
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗六 CaCl2法轉化大腸杆菌
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）各種轉化方法與轉化率的衡量指標
（二）轉化率的影響因素
1試劑（包括水）純度與器皿清潔程度的影響
2接種前菌種保存方式的影響
3宿主菌生長時期的影響
4CaCl2法0℃放置時間的影響
5化閤物與無機離子的影響
6質粒大小、構型與復製起點的影響
7競爭DNA的影響
8共轉化質粒的影響
9質粒DNA與轉化細胞比例的影響
10菌株基因型recA＋與recA 的影響
11連接緩衝液的影響
（三）大腸杆菌中的限製係統與限製修飾係統
1Mcr限製係統
2Mrr限製係統
3hsd限製修飾係統
（四）宿主菌的選擇
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗七 酚/氯仿法快速鑒定轉化子
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）DNA水平檢測
1快速抽提電泳分析
2快速抽提酶切分析
3原位雜交法
4斑點雜交法
5Southern雜交法
6DNA序列分析
（二）mRNA水平檢測
1R環電子顯微鏡法檢測
2雜交抑製翻譯
3雜交選擇翻譯
（三）蛋白質水平檢測
1沉澱免疫檢測法
2其他免疫檢測法
（四）功能水平檢測
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗八 隨機引物法標記DNA探針
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）酶法標記於鏈上
1缺口轉移法
2隨機引物法
3PCR法
（二）酶法標記於末端
13′末端標記法
25＇末端標記法
（三）化學法標記於鏈上
1直接標記法
2介導標記法
（四）化學法標記於末端
1閤成時引入氨基或巰基
2閤成後引入氨基或巰基
（五）光化學法標記於鏈上
1芳香疊氮化閤物
2呋喃香豆素衍生物
（六）人工閤成於鏈上
1摻入堿基類似物
2摻入核糖類似物
（七）檢測酶直接標記法
1檢測酶直接標記於鏈上
2檢測酶直接標記於末端
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗九 菌落原位吸印
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）各類吸印膜
1硝酸縴維素膜（NC膜）
2疊氮氧苄甲基縴維素紙（DBM紙），重氮苯硫醚
縴維素紙（DPT紙）和氨基苯硫醚縴維素紙（APT
紙）
3二乙氨基乙基縴維素紙（DEAE紙）
4ECTELA紙
5尼龍膜
6聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）
7其他膜
（二）各種轉移方法
1毛細管轉移法
2真空轉移法
3電轉移法
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗十 DNA分子雜交
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）DNA的復性與雜交反應動力學方程式
1雙鏈DNA的復性過程
2單鏈探針的雜交過程
3雙鏈探針的雜交過程
（二）雜交速率的影響因素
1探針分子復雜性的影響
2探針分子濃度的影響
3雜交溫度的影響
4雜交液pH值的影響
5雜交液中離子強度的影響
6雜交液中甲酰胺濃度的影響
7雜交促進劑的影響
（三）雜交反應的兩種模式
（四）雜交分子穩定性的影響
1雜交液中Na＋離子濃度的影響
2探針分子中GC％的影響
3雜交液中甲酰胺濃度的影響
4探針分子長度的影響
5與目標DNA錯配的影響
6雜交液pH值的影響
（五）雜交的步驟
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗十一 顯色法檢測雜交結果
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）酶法顯色原理
1辣根過氧化物酶
2堿性磷酸酯酶
（二）免疫法檢測原理
（三）生物素－親和素法檢測原理
（四）其他檢測法
1膠體金標記――銀加強檢測法
2時間分辨熒光檢測法
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗十二 PCR法鑒定人的性彆
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）PCR的引物設計
1引物的長度
2引物的GC％含量
3引物的3′端起始堿基
4引物無迴文對稱結構
5引物自身不能配對
6兩個引物的Tm值
7兩個引物之間不能配對
（二）PCR的反應體係
1模闆DNA
2引物
三 分光光度計的使用
四 電泳儀的使用
五 微量移液器的使用
六 凝膠攝影
七 酚的重蒸與飽和處理
八 RNA酶的使用與預處理
九 緩衝液作用原理與Tris・Cl的配製
十 菌種與DNA樣品的保存
十一 器皿的清洗處理
十二 器皿和試劑的滅菌處理
十三 器皿的矽化處理
十四 大腸杆菌常用基因型
參考文獻
· · · · · · (收起)
讀後感
用戶評價
我是一名正在準備畢業設計的研究生，手頭有許多不同版本的實驗指導書，但這本書給我的感覺是最“實用”和“貼近一綫操作”的。它沒有過多糾纏於晦澀難懂的理論推導，而是將重點放在瞭“怎麼做”和“為什麼這麼做”上。很多章節對於關鍵步驟的操作技巧描述得極其到位，比如離心管的蓋緊程度、酶的加入順序、PCR擴增的退火溫度優化等，這些都是教科書上往往一筆帶過，但在實際操作中決定成敗的關鍵點。讀完這部分內容，我感覺自己仿佛站在瞭操作颱前，跟著作者的指導一步步完成實驗，這種沉浸式的學習體驗，遠比單純記憶公式或步驟來得有效得多。這本書無疑是實驗室裏不可或缺的“實戰手冊”。
评分我注意到這本書的語言風格非常嚴謹且富有邏輯性，但同時又保持著一種恰到好處的學術親和力，沒有那種高高在上的說教感。作者善於使用精確的術語，確保專業性和準確性，但在解釋復雜概念時，又能用清晰、簡潔的語言進行闡述，避免瞭不必要的晦澀。對於某些容易混淆的概念，作者會特意設置對比分析或易錯點提醒，這種細緻入微的關懷，體現瞭編者對學生學習難點的深刻理解。閱讀過程中，我感覺像是在與一位經驗豐富、耐心細緻的導師進行深入的探討，總能在關鍵時刻得到啓發和指引，讓人感到非常安心和信服。
评分這本書的結構安排顯示齣作者深厚的教學功底和對學科脈絡的精準把握。它並非簡單地羅列技術點，而是構建瞭一個邏輯嚴密的知識體係。從基礎的前處理技術，到核心的分子生物學技術，再到後期的分析與鑒定方法，層層遞進，相互關聯。更難得的是，它在介紹每一種技術時，都會穿插相關的應用案例，這使得抽象的技術操作有瞭具象化的意義。比如，在講解某個分離技術時，會立即引齣它在疾病診斷中的實際應用，這種理論與實踐的無縫銜接，極大地提升瞭知識的深度和廣度。對於希望構建完整技術知識框架的學習者來說，這本書提供瞭絕佳的藍圖。
评分這本教材的排版和插圖真是太讓人眼前一亮瞭。封麵設計簡約而不失科技感，內頁的布局也十分清晰閤理，閱讀體驗極佳。特彆是那些流程圖和實驗步驟的示意圖，繪製得非常精細，幾乎不需要額外的文字解釋就能讓人明白其中的關鍵環節。我尤其欣賞它在細節上的處理，比如不同實驗技術的原理圖，不僅準確，而且色彩搭配閤理，讓人在學習復雜概念時也能感到愉悅。書本的紙張質量也很好，觸感溫潤，長時間翻閱也不會覺得纍。感覺作者在設計這本書的視覺呈現上花費瞭大量的心思，使得原本可能枯燥的實驗技術內容變得生動活潑起來，這對於初學者來說無疑是一個巨大的福音，能有效降低閱讀的畏難情緒，讓人更有動力去探索接下來的內容。
评分從設備和耗材的選擇角度來看，這本書的參考價值極高。它不僅描述瞭實驗步驟，還對不同實驗平颱和試劑的優劣進行瞭客觀的比較和評價。例如，在介紹某個分析檢測方法時，書中會對比不同型號的檢測儀器的靈敏度和準確性，並給齣不同品牌試劑盒的適用範圍建議。這種貼近采購和實際運行成本的考量，對於指導實驗室建設和項目預算非常有幫助。它不僅僅是一本教學用書，更像是一本兼顧效率、成本與質量的綜閤技術決策指南。對於經費有限但追求高質量數據的研究者來說，書中提供的這些“軟信息”的價值甚至超過瞭純粹的“硬操作”。
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