cDNA Preparation and Characterization, Volume 303 pdf epub mobi txt 电子书 下载 2026

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出版者:Academic Press

作者:

出品人:

页数:575

译者:

出版时间:1999-5-31

价格:USD 187.00

装帧:Hardcover

isbn号码:9780121822040

丛书系列:

图书标签:

• cDNA
• Molecular Biology
• Gene Expression
• RNA
• Biotechnology
• Genomics
• Cloning
• PCR
• Laboratory Techniques
• Bioengineering

《基因工程先锋：核酸文库构建与深入分析》 第一章：引言 - 探索基因组的宝藏 本卷将带领读者踏上一段激动人心的旅程，深入探索生命最基本的信息载体——基因组。我们将从分子生物学的基石出发，阐述研究基因组信息的重要性，以及为何核酸文库的构建成为理解生命奥秘不可或缺的一环。从宏观的基因组结构到微观的基因功能，每一章都将逐步揭示构建高效核酸文库的理论基础和实践指导，为读者奠定坚实的知识框架。我们将探讨基因组学在疾病诊断、药物开发、生物技术创新等领域的广泛应用前景，激发读者对基因科学研究的浓厚兴趣。 第二章：核酸提取与纯化 - 基因信息的基石 在构建任何核酸文库之前，高质量的起始材料至关重要。本章将详细介绍从各类生物样本（包括组织、细胞、血液、微生物等）中高效提取和纯化DNA和RNA的技术。我们将深入探讨不同提取方法的原理、优缺点以及适用范围，例如酚-氯仿抽提法、硅基柱纯化法、磁珠法等。同时，本章还将重点介绍核酸质量和数量的评估方法，包括分光光度法、荧光定量法以及凝胶电泳分析，确保后续文库构建的成功率。我们将详细讲解各种试剂的选择、操作步骤的细节以及可能遇到的问题及解决方案，让读者能够熟练掌握这一基础但关键的实验技能。 第三章：cDNA合成 - 锁定信使RNA的秘密 cDNA（互补DNA）作为基因表达的直接反映，在基因功能研究、基因克隆以及基因疗法开发中扮演着核心角色。本章将聚焦于cDNA的合成过程，从逆转录酶的分子机制到不同逆转录体系的选择，都将进行详尽的阐述。我们将详细介绍单链cDNA和双链cDNA的合成策略，包括OLIGO(dT)引物、随机引物以及特异性引物的应用。同时，本章还将讨论影响cDNA合成效率的各种因素，如RNA的质量、引物的选择、反应温度和时间等，并提供优化策略。我们将带领读者一步步理解如何高效、准确地将mRNA转化为稳定的cDNA分子，为构建基因表达文库奠定基础。 第四章：核酸文库构建策略 - 多样化的基因信息库 本章将深入探讨各种核酸文库的构建策略，以满足不同研究目的的需求。我们将详细介绍基因组DNA文库（包括基因组BAC/YAC文库、基因组Shotgun文库）和cDNA文库（包括全长cDNA文库、差表达cDNA文库）的构建原理和方法。对于cDNA文库，我们将重点介绍如何构建代表不同组织、发育阶段或疾病状态的文库，以捕捉关键的基因表达信息。此外，我们还将探讨高效捕获稀有转录本的策略，例如基于代表性不足PCR（SSH）的技术，以及利用特定适配子的技术。读者将在此章节了解如何根据研究目标选择最适合的文库构建策略，并掌握构建具有高覆盖度、低背景的核酸文库的关键技术。 第五章：文库噬菌体载体的选择与应用 - 基因组信息的载体 噬菌体载体因其高效的包装能力、稳定的遗传特性以及易于操作等优点，在核酸文库的构建和筛选中发挥着举足轻重的作用。本章将详细介绍λ噬菌体、M13噬菌体以及Cos噬菌体等常用噬菌体载体的结构、特点及其在文库构建中的应用。我们将深入探讨不同噬菌体载体在文库覆盖度、插入片段大小以及筛选效率方面的差异。同时，本章还将详细介绍如何将基因组DNA或cDNA片段高效地插入到噬菌体载体中，并进行病毒包装，形成高滴度的噬菌体文库。读者将在此章节理解不同噬菌体载体的适用性，并掌握构建和维持高质量噬菌体文库的关键技术。 第六章：酵母人工染色体（YAC）文库的构建与优势 - 宏基因组研究的新纪元 酵母人工染色体（YAC）技术是构建高分子量DNA文库的强大工具，能够容纳大片段的基因组DNA，为宏基因组研究和基因组物理图谱的构建提供了前所未有的便利。本章将深入介绍YAC文库的构建原理，包括DNA的提取、限制性内切酶消化、与YAC载体的连接以及酵母转化等关键步骤。我们将详细讨论YAC载体的设计特点，以及影响YAC文库稳定性和覆盖度的因素。此外，本章还将重点阐述YAC文库在解析复杂基因组、研究基因调控网络以及定位遗传性疾病基因等方面的巨大优势。读者将在此章节深入理解YAC技术在基因组学研究中的重要地位，并学习如何构建和利用YAC文库。 第七章：细菌人工染色体（BAC）文库的构建与应用 - 精准基因组导航 细菌人工染色体（BAC）技术以其稳定性、易于操作以及能够容纳中等至大片段DNA的特点，成为当前基因组克隆和物理图谱构建的主流技术。本章将详细介绍BAC文库的构建流程，包括高质量基因组DNA的提取、部分消化、BAC载体的连接、大肠杆菌转化以及文库的筛选和扩增。我们将深入探讨BAC载体的设计原理，以及如何优化BAC文库的覆盖度和稳定性。此外，本章还将重点介绍BAC文库在基因组测序、基因定位、基因功能研究以及构建转基因动物模型等方面的广泛应用。读者将在此章节掌握BAC文库构建的核心技术，并了解其在现代基因组学研究中的关键作用。 第八章：mRNA差异显示（CDGE）技术 - 捕捉关键基因表达信号 mRNA差异显示（CDGE）技术是一种简单、高效地识别两种或多种条件下基因表达差异的方法。本章将详细介绍CDGE技术的原理，包括mRNA的反转录、PCR扩增以及聚丙烯酰胺凝胶电泳。我们将重点讨论如何选择合适的PCR条件，如何优化电泳参数以获得清晰的条带，以及如何对差异表达的条带进行克隆和鉴定。本章还将介绍CDGE技术的应用，例如在肿瘤研究、发育生物学以及药物筛选等领域。读者将在此章节掌握CDGE技术的基本操作，并学会如何利用该技术快速发现和验证差异表达基因。 第九章：基因表达序列标签（EST）文库的构建与分析 - 基因功能研究的窗口 基因表达序列标签（EST）文库是基因组信息的重要补充，它代表了基因的转录区域，是快速识别和研究基因功能的重要工具。本章将详细介绍EST文库的构建过程，包括mRNA的提取、cDNA的合成、适配子的连接以及PCR扩增。我们将重点讨论如何构建代表性强的EST文库，以及如何进行EST的测序和序列比对。此外，本章还将介绍EST数据在基因组注释、蛋白质组学研究以及基因功能预测等方面的应用。读者将在此章节了解EST文库构建和分析的基本流程，并掌握如何利用EST数据来探索基因的功能。 第十章：文库筛选策略 - 从海量信息中定位目标 构建的核酸文库往往包含数以万计的克隆，如何从中高效地筛选出目标基因或感兴趣的DNA片段是文库应用的关键。本章将系统介绍各种文库筛选策略，包括噬菌体斑块杂交筛选、菌落PCR筛选、荧光原位杂交（FISH）筛选以及高通量筛选方法。我们将详细阐述不同筛选方法的原理、试剂选择、操作步骤以及优化技巧。同时，本章还将讨论如何设计合适的探针，以及如何提高筛选的特异性和灵敏度。读者将在此章节掌握从大型核酸文库中快速、准确地定位目标DNA片段的核心技术。 第十一章：文库的储存与管理 - 保护基因信息的宝贵资产 核酸文库的质量和稳定性直接影响后续研究的成败。本章将提供关于核酸文库的储存和管理的详细指南，包括文库的长期储存条件（如超低温冷冻、甘油储存法）、文库滴度的测定与维持，以及防止污染和降解的措施。我们将强调规范化的文库管理流程，包括详细的标签记录、库存管理以及定期质量检查的重要性。读者将在此章节学习如何妥善保存和管理自己构建的核酸文库，以确保其能够长久地为科学研究提供宝贵的资源。 第十二章：应用案例与未来展望 - 驱动生命科学的进步 本卷的最后一章将通过具体的应用案例，展示核酸文库在各个领域的强大力量。我们将探讨如何利用构建的文库来研究基因组的结构和功能、发现新的致病基因、开发新型诊断工具以及设计靶向治疗药物。此外，本章还将对核酸文库技术的发展趋势进行展望，包括下一代测序技术的融合、单细胞水平的文库构建以及人工智能在文库分析中的应用，为读者勾勒出未来生命科学研究的宏伟蓝图。

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这部《cDNA Preparation and Characterization, Volume 303》真是让人又爱又恨。我抱着极大的热情开始阅读，希望能找到一些关于构建高质量cDNA文库的独家秘籍，毕竟在当前的分子生物学研究中，cDNA的质量直接决定了下游测序和表达分析的成败。然而，书中的某些章节，特别是关于样本采集和初始RNA纯化的部分，感觉写得有些过于理论化，缺乏实际操作中会遇到的那些“坑”的解决方案。比如，它详细描述了Trizol法提取RNA的步骤，却对在处理高黏度组织或含RNase活性极高的样本时，如何通过优化研磨和裂解过程来最大化产量和纯度着墨不多。我期待的更多是那些资深实验员才会知道的“小窍门”，比如不同批次DNase I的活性差异对后续cDNA合成的影响，或者在进行逆转录反应时，究竟是使用随机引物、寡聚dT还是基因特异性引物，在不同物种、不同组织来源的RNA样本中，哪种策略的偏好性更低。书中的图表清晰度尚可，但部分流程图的简化处理，使得初学者很容易忽略掉一些关键的缓冲液浓度调整的细微差别，而这些差别往往是决定最终cDNA克隆效率的关键所在。总体来说，它更像是一本严谨的教科书，而非一本实用的“野外生存指南”。

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我不得不承认，《cDNA Preparation and Characterization, Volume 303》在基础原理的阐述上确实无可挑剔，它为理解逆转录过程中的每一个酶促步骤提供了坚实的理论基石。然而，作为一本面向“准备和表征”的工具书，其对实验自动化和高通量筛选的整合度令人失望。在如今大多数实验室都依赖于自动化液体处理工作站进行大规模cDNA合成和文库构建的背景下，书中对手工操作的细节描述过多，却对如何将这些步骤“模块化”并导入机器流程中缺乏指导。例如，如何设置自动移液器进行精确到纳升的试剂分配，如何处理因毛细管效应导致的体积误差，这些现代实验室工作流程的关键点，书中付之阙如。我特别想了解的是，在处理上百个样本时，如何设计一个鲁棒的质量控制流程，能够在中间阶段快速筛选掉那些潜在的污染或无效批次，而不是等到整个文库构建完成后才发现问题。这本书的视角似乎停留在“一台设备、一个样本”的精细操作层面，与当前追求效率和规模化的生物技术前沿有些脱节，因此在实际应用中，我需要大量的“翻译”工作才能将其转化为可操作的自动化方案。

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这本书的语言风格和叙事节奏，给我的感觉是相当“学院派”的，一丝不苟，但缺乏必要的活力。它仿佛是从上世纪末的实验室标准操作程序（SOP）汇编中直接摘录出来的，信息密度极高，但读起来却需要极大的专注力去消化那些密集的化学反应方程式和酶促动力学描述。我特别希望能在其中找到一些关于高通量测序（NGS）时代背景下，cDNA制备流程如何适应Illumina平台或PacBio平台的具体调整。比如，在连接通用接头（Adapter Ligation）的步骤中，如何平衡连接效率与GC含量对PCR扩增偏倚的影响，这些实践中的权衡之道，书中并未给出足够的案例分析或对比数据。我尝试根据书中的建议去构建一个用于RNA-seq的cDNA库，结果发现，在后续的PCR扩增阶段，背景噪音过高，大量的非特异性扩增产物占据了测序深度。这让我不得不反思，是不是书中那些看似通用的酶切和连接条件，在面对现代高灵敏度测序文库的需求时，已经显得过于保守或不精确了。它像是关于如何制造一辆经典老爷车的说明书，而我需要的却是关于如何驾驶一辆F1赛车的技术手册。

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这本书给我的最深刻印象是其“时间感”略显滞后。它的内容无疑是建立在稳固的生物化学基础之上的，但科学技术的发展是日新月异的，尤其是在核酸技术领域。书中对cDNA合成的描述，似乎更多地聚焦于传统的基于聚合酶的延伸反应，而对于近年来迅速兴起的基于纳米孔测序（Nanopore Sequencing）或直接RNA测序技术中对cDNA准备的特殊要求，则几乎没有涉及。例如，直接RNA测序技术对cDNA链的完整性和端部修饰的敏感度极高，要求逆转录酶在合成第一链时保持极高的保真度和极低的脱落率。这本书对不同逆转录酶（如MMLV、AMV、或更现代的高保真酶）的系统性比较评述，未能充分体现出它们在处理高难度模板（如长RNA或二级结构复杂的RNA）时的性能差异。读完此书，我感觉自己掌握了“如何制作一份完美的20年前的cDNA文库”，但对于如何应对当前正在主导领域的最新测序技术范式所带来的挑战，它提供的指引显得有些力不从心，更像是一份珍贵的历史文献，而非即时可用的操作手册。

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阅读《cDNA Preparation and Characterization, Volume 303》的过程，体验颇有些像是在攀登一座技术难度适中的山峰。它的结构布局是相当严谨的，从核酸提取的理论基础开始，逐步过渡到逆转录酶的选择和优化，再到最终的文库构建和初步的序列验证。然而，真正令我感到困惑的是，书中对“表征”（Characterization）部分的深度似乎有所欠缺。我们都知道，制备出cDNA只是第一步，如何确保这个cDNA代表了原始细胞的真实转录组状态，才是重中之重。书中对于如何利用Bioanalyzer或TapeStation对cDNA片段大小分布进行精确评估，以及如何通过qPCR对特定已知基因的表达水平进行交叉验证的讨论，篇幅略显单薄。更令人费解的是，对于那些处理降解RNA样本的策略——这在临床样本和年代久远的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中是家常便饭——书中仅提供了寥寥数语的提及，没有深入探讨如何利用“部分序列化”或“片段富集”等高级技术来挽救这些“问题样本”。对于追求前沿应用，尤其是处理非模式生物或降解样本的研究者而言，这本书提供的工具箱略显陈旧，缺少了应对复杂挑战的创新性补丁。

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