Condensed Protocols from Molecular Cloning pdf epub mobi txt 电子书 下载 2026

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出版者:Cold Spring Harbor Laboratory Press

作者:Joseph Sambrook

出品人:

页数:800

译者:

出版时间:2006-05-31

价格:USD 99.00

装帧:Paperback

isbn号码:9780879697716

丛书系列:

图书标签:

• 分子克隆
• 分子生物学
• 实验方案
• 生物技术
• 基因工程
• DNA
• RNA
• 蛋白质
• 实验室手册
• 生物化学

实验室技术深度解析与实践指南：从基础到前沿的生物技术全景梳理 本书旨在为生物科学领域的学生、研究人员和技术人员提供一本全面、深入且高度实用的实验室技术操作手册。它摒弃了对单一或特定领域（如分子克隆或特定测序技术）的聚焦，而是致力于构建一个涵盖当前生命科学研究核心方法论的宏观技术图谱。 第一部分：生物分子提取与纯化——实验的基石 本部分详细阐述了从复杂生物样本中分离和纯化关键生物分子的优化策略与疑难解答。 第一章：高质量核酸提取的优化路径 组织与细胞裂解技术的多样性： 深入探讨了机械裂解（研磨、匀浆、超声）、酶促裂解（蛋白酶K、溶菌酶）和化学裂解（SDS、胍盐）在不同样本类型（如植物韧皮部、真菌细胞壁、冷冻保存的哺乳动物组织）中的适用性与效率对比。特别关注了如何选择合适的组织匀浆介质以最大程度抑制核酸酶活性。 RNA 提取的挑战与对策： 重点分析了 RNA 极易降解的特性，详述了使用硫氰酸胍或异硫氰酸胍作为强变性剂和抑制剂的机制。介绍了从富含多糖、多酚或高粘性样本中提取高纯度、高完整性 RNA 的专门流程，包括沉淀步骤的优化（如 LiCl 沉淀法）。 质粒 DNA 的纯化进阶： 除了标准的碱裂解法，本书还详细介绍了通过选择性沉淀（PEG 沉淀）去除污染物的技术，以及应对超螺旋、线性、开放环等多种质粒形态的纯化策略。讨论了旋转柱技术（Spin Column）在自动化和高通量环境中的性能优势与局限性。 第二章：蛋白质组学前处理与分离技术 高效的细胞溶解与蛋白提取： 分析了 RIPA 缓冲液、NP-40 缓冲液等不同去污剂的性质，以及它们对膜蛋白和细胞器蛋白提取的特异性影响。提供了优化变性剂（尿素、硫脲）浓度以确保蛋白完全溶解而又不损害其后续应用潜能（如免疫检测）的指南。 基于层析的蛋白质纯化策略： 详细剖析了亲和层析（Affinity Chromatography，如 His-tag 纯化、GST 纯化）的动力学原理和优化载柱装载条件的参数。同时，对离子交换层析（IEX）和分子筛层析（SEC）在初步分离和去除盐浓度干扰方面的应用进行了深入探讨。 二维电泳（2-DE）的实践难题与解决方案： 聚焦于等电聚焦（IEF）过程中的蛋白质聚集、溴酚蓝污染以及条带拖尾现象的排查与解决。 第二部分：核心分子生物学工具箱——从构建到定量 本部分聚焦于实现基因操作、信号检测和目标物量化的关键技术平台。 第三章：聚合酶链式反应（PCR）的精确控制 热循环参数的精细调控： 深入讲解了退火温度（$T_a$）的准确计算、延伸时间的设定与酶活性的关系，以及对不同长度模板的特异性引物设计原则。 复杂模板的 PCR 应对： 提供了使用添加剂（如 DMSO、甜菜碱）克服高 GC 含量模板或结构复杂 DNA 的方法。讨论了如何通过两步法或热启动酶策略提高反应的特异性。 实时定量 PCR (qPCR) 的数据解读与验证： 阐述了扩增效率（Efficiency）的评估方法（$E = 10^{-1/slope}$）及其对 $C_t$ 值的修正意义。详细说明了内参基因的选择标准、溶解曲线分析的必要性，以及如何排除引物二聚体对定量结果的干扰。 第四章：文库构建与高通量测序技术基础 下一代测序（NGS）的文库制备流程： 从片段化（酶切或超声波）开始，详述了接头（Adapter）的连接效率、长度选择对不同类型测序（如全基因组重测序 vs. 转录组 RNA-Seq）的影响。 宏基因组与单细胞文库的特殊要求： 针对低起始材料或复杂微生物群落的特点，介绍了适用于低起始投入的扩增策略（如 MDA, WGA）以及在单细胞水平上捕获和标记 cDNA 的技术壁垒。 第三部分：蛋白质功能验证与可视化技术 第五章：免疫学检测的高分辨率方法 Western Blotting 的信号优化： 详述了从转膜条件（湿转、干转）、封闭液选择（BSA vs. 脱脂奶粉）到抗体孵育参数（时间、温度）对检测灵敏度的影响。提供了针对低丰度蛋白的增强化学发光（ECL）体系优化方案。 免疫组织化学（IHC）与免疫荧光（IF）的组织处理： 重点解析了抗原修复（热修复 AR9/AR6、酶修复）在不同固定剂（福尔马林、多聚甲醛）样本中的选择依据。讨论了荧光串扰（Crosstalk）的校正技术，以及多重免疫荧光染色（Multiplexing）的通道兼容性问题。 第六章：细胞成像与活细胞分析的高级应用 共聚焦显微镜（Confocal Microscopy）的操作深度： 解释了针孔（Pinhole）设置如何影响光学切片的厚度和分辨率（阿贝衍射极限）。详细说明了光漂白（Photobleaching）的预防措施，以及时间分辨荧光寿命成像（FLIM）在细胞内环境监测中的优势。 流式细胞术（FACS）的高维分析： 阐述了荧光补偿（Compensation）的必要性，并指导读者如何设置合理的电压和增益，以区分低表达水平的细胞群体。介绍了细胞分选（Sorting）中的污染控制和细胞活力维持策略。 第七章：生物信息学初步数据处理与质量控制 本章侧重于实验数据向有效结论转化的第一步。 原始数据质量评估： 介绍了 FastQC 等工具对原始测序数据的基本指标（如质量得分分布、GC 含量、接头序列残留）的解读。强调了去除低质量读段（Trimming）对下游分析结果的决定性影响。 数据标准化与比较分析： 讨论了 qPCR 数据中 $Delta Delta C_t$ 方法的理论前提与统计局限性。对于高通量数据，介绍了 RPKM/FPKM/TPM 等标准化指标的选择标准，以及如何使用批次效应校正（Batch Effect Correction）方法来确保实验间结果的可比性。 本书通过这种多维度、深层次的技术剖析，旨在帮助研究人员系统地理解并掌握现代生物学实验的“内功心法”，从而有效提高实验的成功率、数据可靠性和研究的创新性。

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